由于底物转化率高、产氢量大、可吸收的太阳能光谱较宽及底物来源广泛等优点，紫色非硫光合细菌（purple non-sulfur photosynthetic bacteria, PNSB）介导的光发酵制氢被认为是最具潜力的生物制氢方法之一（图1）。然而，PNSB胞内ATP和还原力的供给不足限制了固氮酶活性和氢气的合成。因此，迫切需要有效的多维度策略来提高ATP和还原力供给，以提高PNSB产氢性能。

近日，袁吉锋教授、张阳助理教授与西安交通大学郭烈锦院士合作在Chemical Engineering Journal上发表了一篇题为“Multidimensional engineering of Rhodobacter sphaeroides for enhanced photo-fermentative hydrogen production”的研究论文。该论文在球形红细菌中改造捕光复合物、电子传递链、ADP合成路径、F₀F₁-ATPase表达、以及固氮酶表达，多维度提高ATP和还原力供给，最优菌株在摇瓶分批补料发酵中产氢量为17630.4 mL/L，产氢速率和产氢得率分别为61.2 mL/(Lh)和3.0 mol/mol-acetate，这代表了目前最高产氢性能的菌株之一，为光发酵制氢的应用发展提供有力的支撑。

研究人员前期在球形红细菌中构建了吸氢酶缺失突变株，以阻断氢气的消耗途径，以此突变株作为底盘进行改造研究。首先，光合作用为ATP和还原力NADH合成提供能量，其中捕光复合物主要起吸收、转化光能作用，包含光合色素和蛋白。而高色素会加重光屏蔽效应，影响反应器内部细胞吸收光能。因此，我们通过敲除pucBA，大幅降低捕光复合物II含量。随后，基因整合方式过表达调控因子pufQ和spbA，以降低捕光复合物I含量，显著提高产氢（图2）。

其次，电子传递链不仅影响ATP合成，也影响还原力合成。因此，我们系统研究了球形红细菌的4个终端氧化酶对产氢的影响。实验结果表明，细胞色素氧化酶cbb₃和醌氧化酶Qxt的缺失对产氢有利，而醌氧化酶Qox的缺失则不利于产氢，细胞色素氧化酶caa₃缺失对产氢没有显著影响。我们推测，醌氧化酶Qxt是低效的电子载体，而细胞色素氧化酶cbb₃参与固氮酶的负调控，因此其缺失有利于产氢（图3）。

此外，通过增加ADP合成前体的供应和阻断ADP合成前体的消耗，也被证明有助于产氢性能的提高。随后，我们对F₀F₁-ATPase的F₀部分进行表达调控，分别过表达其重要的亚基。实验结果表明，atpB (subunit a，参与质子易位)、atpXF (subunits bbʹ，连接F₀和F₁)及整个f₀ 操纵子过表达有利于ATP合成和固氮酶产氢。其中atpXF过表达不仅提高了其余的f₀基因表达，也提高了所有f₁基因表达，其对产氢性能提升最为显著。

最后，基于上述改造，我们利用转座子随机整合固氮酶nifHDK和atpXF，并提高抗生素筛选浓度以提高整合拷贝数。我们获得高产氢性能的突变株YH27，并解析其插入位点（图4）。在摇瓶光发酵中，乙酸作为碳源分批补料，取得产氢量为17630.4 mL/L，产氢速率和产氢得率分别为61.2 mL/(Lh)和3.0 mol/mol-acetate，据我们所知这是利用乙酸产氢的最高产量。本研究的改造策略也为其他PNSB优化产氢提供有力的借鉴，推动光发酵制氢的发展。

图1：光发酵制氢原理

图2：改造捕光复合物提高产氢性能

图3：改造电子传递链提高产氢性能

图4：转座子辅助nifHDK和atpXF过表达提高产氢性能

伟德国际官网登录入口袁吉锋教授、张阳助理教授以及西安交通大学郭烈锦教授为该论文的通讯作者，该研究得到了广东省自然科学基金（2021A1515110340）、国家自然科学基金（51888103、 32270087）、中央高校基本科研业务费（20720220086）的资助。

论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894724023398

（图/文 袁吉锋课题组）